Biopolym. Cell. 2015; 31(4):285-293.
Молекулярная и клеточная биотехнологии
Получение и анализ трансгенных растений моркови и сельдерея, способных экспрессировать рекомбинантный белок тауматин II
1Лучакивская Ю. С., 1Комарницкий И. К., 2Курченко И. Н., 2Юрьева Е. М., 2Житкевич Н. В., 1Кучук Н. В.
  1. Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины
    ул. Академика Заболотного, 148, Киев, Украина, 03680
  2. Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного НАН Украины
    ул. Академика Заболотного, 154, Киев, Украина, 03680

Abstract

Цель. Получить трансгенные растения моркови и сельдерея экспрессирующие рекомбинантный тауматин II с целью повышения стресс-устойчивости этих культур. Ме­то­ды. Для получения трансгенных растений проводили Agrobacterium-опосредованную трансформацию. Присутс­твие и транскрипцию трансгенов подтверждали с помощью ПЦР и ОТ-ПЦР анализов. Определяли устойчивость полученных растений к биотическим стресс-факторам (анализ антибактериальной/антифунгальной активности in vitro) и к действию солевого/ осмотического стресса (тест на выживывание растений в присутствии NaCl/ПЭГ в различных концентрациях). Результаты. Трансгенные растения моркови и сельдерея, экспрессирующие ген тауматина II (транскрипция подтверждена для 60–100 %) были получены путем агробактериальной трансформации. Экстракты трансгенных растений моркови ингибировали рост исследуемых штаммов фитопатогенных бактерий, но не проявляли антифунгальной активности. Уровень выживания трансгенных растений при абиотическом стрессе был значительно выше по сравнению с нетрансгенными растениями. Анализ содержания фотосинтетических пигментов не показал достоверной разницы показателей для трансгенных растений при солевом стрессе, что может указывать на возможную защитную активность рекомбинантного белка. Выводы. По­лученные в наших исследованиях трансгенные растения сельдерея и моркови, экспрессирующие рекомбинантный тауматин II, характеризовались антибактериальной активностью и повышенной устойчивостью к солевому и осмотическому стрессу.
Keywords: морковь, сельдерей, тауматин, Agro­bac­te­rium-опосредованная трансформация, стресс-устойчивость.

References

[1] Parvaiz A, Satyawati S. Salt stress and phytobiochemical responses of plants – a review. Plant Soil Environ. 2008;54(3):89–9
[2] Rajam MV, Chandola N, Saiprasad Goud P, Singh D, Kashyap V, Choudhary ML, Sihachakr D. Thaumatin gene confers resistance to fungal pathogens as well as tolerance to abiotic stresses in transgenic tobacco plants. Biol Plant.2007; 51(1):135–41.
[3] Chen W, Punja Z. Transgenic herbicide- and disease-tolerant carrot (Daucus carota L.) plants obtained through Agrobacterium-mediated transformation. Plant Cell Rep. 2002; 20(10): 929–35.
[4] Schestibratov KA, Dolgov SV. Transgenic strawberry plants expressing a thaumatin II gene demonstrate enhanced resistance to Botrytis cinerea. Sci Hortic. 2005; 106(2): 177–89.
[5] Hu X, Reddy AS. Cloning and expression of a PR5-like protein from Arabidopsis: inhibition of fungal growth by bacterially expressed protein. Plant Mol Biol. 1997;34(6):949-59.
[6] Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 1962; 15(3):473–97.
[7] Komarnytskii I, Shcherbak N, Kishchenko E. Plant genetic transformation by vector with thaumatin II gene. Re­cent Advances in Plant Genetic Engineering. Kyiw, 2011
[8] Luchakivska Yu, Komarnitskii I, Kuchuk M. Obtaining of transgenic carrot (Daucus carota L.) and celery (Apium graveolens L.) plants expressing the recombinant gene of thaumatin II protein. In Vitro Cell Dev Biol. 2012; 48(4):2069.
[9] Gamborg OL, Miller RA, Ojima K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res. 1968;50(1):151-8.
[10] Doyle JJ, Doyle JL. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 1990; 12:13–5
[11] Draper J, Scott R. Armitage Ph. Plant genetic transformation and gene expression. A laboratory manual. Moscow: Mir, 1991. 780 p.
[12] Lipp João KH, Brown TA. Enhanced transformation of tomato co-cultivated with Agrobacterium tumefaciens C58C1Rif(r)::pGSFR1161 in the presence of acetosyringone. Plant Cell Rep. 1993;12(7-8):422-5.
[13] Logemann J, Schell J, Willmitzer L. Improved method for the isolation of RNA from plant tissues. Anal Biochem. 1987;163(1):16-20.
[14] Methods of experimental mycology. Kiev: Naukova dumka, 1982; 550 p.
[15] Bilai VI. Fusaria. Kyiv, Naukona dumka, 1977; 443 p.
[16] Domsch KH, Gams W, Anderson T-H. Compendium of soil fungi. Eching: IHW-Verlag, 2007. 672 p.
[17] Klochenko PD, Elanskaya I, Shevchenko T, Sokolova E. Antifungal activity of freshwater cyanobacteria. Algol Stud. 2001; 103:143–9.
[18] Hoffmann WA, Poorter H. Avoiding bias in calculations of relative growth rate. Ann Bot. 2002;90(1):37-42.
[19] Rees M, Osborne CP, Woodward FI, Hulme SP, Turnbull LA, Taylor SH. Partitioning the components of relative growth rate: how important is plant size variation? Am Nat. 2010;176(6):E152-61.
[20] Wellburn AR. The Spectral determination of chlorophylls A and B, as well as total carotenoids, using various so­lvents with spectrophotometers of different resolution. J Plant Physiol. 1994; 144(3):307–13.
[21] Gilbert MO, Zhang YY, Punja ZK. Introduction and expression of chitinase encoding genes in carrot following Agrobacterium-mediated transformation. In Vitro Cell Dev Boil. Plant. 1996; 32(3):171–8
[22] Takaichi M, Oeda K. Transgenic carrots with enhanced resistance against two major pathogens, Erysiphe heraclei and Alternaria dauci. Plant Sci. 2000;153(2):135-144.
[23] Kishchenko E, Shcherbak N, Kyrychuk Y, Kuchuk N. Construction of transgenic plants expressing tuberculosis-specific proteins. Abstracts of the 2d meeting of Ukrainian cell biologists organisation. Kyiv, 2007: 32.
[24] Song GQ, Loskutov AV, Sink KC. Highly efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of celery (Apium graveolens L.) through somatic embryogenesis. Plant Cell Tissue Organ Cult. 2007; 88(2):193–200.
[25] Witty M, Harvey WJ. Sensory evaluation of transgenic Solanum tuberosum producing r-thaumatin II. N Z J Crop Hortic Sci. 1990; 18(2–3):77–80.
[26] Bartoszewski G, Niedziela A, Szwacka M, Niemirowicz-Szczytt K. Modification of tomato taste in transgenic plants carrying a thaumatin gene from Thaumatococcus daniellii Benth. Plant Breed. 2003; 122(4):347–51. 1. Parvaiz A, Satyawati S. Salt stress and phytobiochemical responses of plants – a review. Plant Soil Environ. 2008;54(3):89–9.
[27] Szwacka M, Krzymowska M, Osuch A, Kowalczyk ME, Malepszy S. Variable properties of transgenic cucumber plants containing the thaumatin II gene from Thaumatococcus daniellii. Acta Physiol Plant. 2002;24(2):173–85.
[28] Dolgov SV, Lebedev VG, Firsov AP, Taran SA, Tjukavin GB. Expression of thaumatin II gene in horticultural crops. Genetics and Breeding for Crop Quality and Resistance. 1999;165–72.
[29] Safavi K,Zareie R, Tabatabaie BES. Expression of TLP-3 gene without signal peptide in tobacco plants using Agrobacterium mediated transformation. Afr J Biotechnol. 2011; 10(24):4816–22
[30] Zamani A, Motallebi M, Jonoubi P, Ghafarian-Nia NS, Zamani MR. Heterologous expression of the Secale cereale thaumatin-like protein in transgenic canola plants enhances resistance to stem rot disease. Iran J Biotechnol. 2012;10(2):87–95.
[31] Datta K, Velazhahan R, Oliva N, Ona I, Mew T, Khush GS, Muthukrishnan S, Datta SK. Over-expression of the cloned rice thaumatin-like protein (PR-5) gene in transgenic rice plants enhances environmental friendly resistance to Rhizoctonia causing sheath blight disease. Theor Appl Genet. 1999; 98(6–7):1138–45.
[32] Mahdavi F, Sariah M, Maziah M. Expression of rice thaumatin-like protein gene in transgenic banana plants enhances resistance to fusarium wilt. Appl Biochem Biotechnol. 2012;166(4):1008-19.
[33] Patyka V, Gnatyuk T, Zhitkevych N, Aleksaev O. Sensitivity to pesticides of the number of representatives of the bacterial microbiota soybean. Nauk Zapys Ternop Nats Ped Univer, (Ser. Biol). 2014; 3 (60): 153–5
[34] Kitajima S, Sato F. Plant pathogenesis-related proteins: molecular mechanisms of gene expression and protein function. J Biochem. 1999;125(1):1-8.
[35] Parida AK, Das AB. Salt tolerance and salinity effects on plants: a review. Ecotoxicol Environ Saf. 2005;60(3):324-49.
[36] Mane AV, Karadge BA, Samant JS. Salinity induced changes in photosynthetic pigments and polyphenols of Cymbopogon Nardus (L.) Rendle J Chem Pharm Res. 2010;2(3):338–47.
[37] Mehta P, Jajoo A, Mathur S, Bharti S. Chlorophyll a fluorescence study revealing effects of high salt stress on Pho­tos­ys­tem II in wheat leaves. Plant Physiol Biochem. 2010; 48 (1):16–20.