Biopolym. Cell. 2015; 31(4):309-315.
Методы
Разработка мультиплексной лигазной реакции для анализа однонуклеотидных полиморфизмов генов MTHFR, F5, F2
1Кравченко С. А., 1Чернушин С. Ю., 1Кучеренко А. М., 1Соловьев А. А., 1Лившиц Л. А.
  1. Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины
    ул. Академика Заболотного, 150, Киев, Украина, 03680

Abstract

Однонуклеотидные полиморфизмы являются важной и весомой формой генетического разнообразия ДНК среди индивидов. В настоящее время разработано большое число методов для генотипирования этих полиморфизмов, но среди них мало универсальных и недорогих. Цель. Дизайн олигонуклеотидных зондов и разработка диагностических методик для анализа полиморфных вариантов генов MTHFR, F5, F2 с использованием мультиплексной лигазной реакции. Методы. Гибридизация, лигазная реакция. Результаты. Разработан дизайн специфических LPO и RPO олигонуклеотидных зондов и праймеров, подобран состав и концентрации ключевых компонентов реакционной смеси для MLPA реакции, а также оптимальные температурно-временные режимы. Разработанные методики апробированы на образцах ДНК с различными аллельными вариантами изучаемых полиморфизмов с использованием референсных образцов ДНК. Выводы. Разработанные методики идеально подходят для генотипирования выборочных SNP, которое обычно проводится в небольших научно-исследовательских лабораториях, а также могут быть использованы создания различных тест-систем ДНК-маркеров.
Keywords: полиморфизм, MLPA, нуклеотидное несоответсвие, таутомеризация

References

[1] Komar A. Single nucleotide polymorphisms. Methods in Molecular Biology Vol 578. Humana Press, 2009. 464 p.
[2] Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res. 2002;30(12):e57.
[3] Sellner LN, Taylor GR. MLPA and MAPH: new techniques for detection of gene deletions. Hum Mutat. 2004;23(5):413-9.
[4] Nilsson M, Banér J, Mendel-Hartvig M, Dahl F, Antson DO, Gullberg M, Landegren U. Making ends meet in genetic analysis using padlock probes. Hum Mutat. 2002;19(4):410-5.
[5] Eldering E, Spek CA, Aberson HL, Grummels A, Derks IA, de Vos AF, McElgunn CJ, Schouten JP. Expression profiling via novel multiplex assay allows rapid assessment of gene regulation in defined signalling pathways. Nucleic Acids Res. 2003;31(23):e153.
[6] Nygren AO, Ameziane N, Duarte HM, Vijzelaar RN, Waisfisz Q, Hess CJ, Schouten JP, Errami A. Methylation-specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids Res. 2005;33(14):e128.
[7] Bittel DC, Kibiryeva N, Butler MG. Methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification analysis of subjects with chromosome 15 abnormalities. Genet Test. 2007 Winter;11(4):467-75.
[8] Kozlowski P, Lin M, Meikle L, Kwiatkowski DJ. Robust method for distinguishing heterozygous from homozygous transgenic alleles by multiplex ligation-dependent probe assay. Biotechniques. 2007;42(5):584, 586, 588.
[9] Barbaro M, Oscarson M, Schoumans J, Staaf J, Ivarsson SA, Wedell A. Isolated 46,XY gonadal dysgenesis in two sisters caused by a Xp21.2 interstitial duplication containing the DAX1 gene. J Clin Endocrinol Metab. 2007;92(8):3305-13.
[10] Little S. Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations. Curr Protoc Hum Genet. 2001;Chapter 9:Unit 9.8.
[11] Peyret N, Seneviratne PA, Allawi HT, SantaLucia J Jr. Nearest-neighbor thermodynamics and NMR of DNA sequences with internal A.A, C.C, G.G, and T.T mismatches. Biochemistry. 1999;38(12):3468-77.
[12] Brovarets' OO, Hovorun DM. How many tautomerization pathways connect Watson-Crick-like G*·T DNA base mispair and wobble mismatches? J Biomol Struct Dyn. 2015;33(11):2297-315.
[13] Imhof P, Zahran M. The effect of a G:T mispair on the dynamics of DNA. PLoS One. 2013;8(1):e53305.
[14] Morgan AR. Base mismatches and mutagenesis: how important is tautomerism? Trends Biochem Sci. 1993;18(5):160-3.
[15] Zhao Z, Boerwinkle E. Neighboring-nucleotide effects on single nucleotide polymorphisms: a study of 2.6 million polymorphisms across the human genome. Genome Res. 2002;12(11):1679-86.
[16] Zhang Z, Gerstein M. Patterns of nucleotide substitution, insertion and deletion in the human genome inferred from pseudogenes. Nucleic Acids Res. 2003;31(18):5338-48.
[17] Tatarskyy PF, Kucherenko AM, Kravchenko SA, Shulzhenko DV, Kuznetsova SM, Livshits LA. Ischemic stroke in Ukrainian population: possible involvement of the F2 G20210A, F5 G1691A and MTHFR C677T gene variants. Biopolym Cell. 2010; 26(4):299–305.
[18] Lalouschek W, Schillinger M, Hsieh K, Endler G, Tentschert S, Lang W, Cheng S, Mannhalter C. Matched case-control study on factor V Leiden and the prothrombin G20210A mutation in patients with ischemic stroke/transient ischemic attack up to the age of 60 years. Stroke. 2005;36(7):1405-9.
[19] Woo KS, Chook P, Lolin YI, Cheung AS, Chan LT, Sun YY, Sanderson JE, Metreweli C, Celermajer DS. Hyperho­mo­cyst(e)inemia is a risk factor for arterial endothelial dysfunction in humans. Circulation. 1997;96(8):2542–4.
[20] Marcinkowska M, Wong KK, Kwiatkowski DJ, Kozlowski P. Design and generation of MLPA probe sets for combined copy number and small-mutation analysis of human genes: EGFR as an example. ScientificWorldJournal. 2010;10:2003-18.