Biopolym. Cell. 2003; 19(4):367-373.
Молекулярна та клітинна біотехнології
Суперсинтез альфа-2b інтерферону людини у клітинах Escherichia coli в розчинній формі з використанням системи експресії на основі PHK-полімерази фага Т7
1Славченко І. Ю., 1Борейко О. В., 1Воробей Н. В., 1Черних С. І., 1Кордюм В. А.
  1. ВНДК «Біотехнолог»
    вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, Україна, 03680

Abstract

Розроблено ефективну технологію одержання розчинного альфа-2b інтерферону людини (ІФН) з використанням системи експресії на основі PHK-полімерази фага Т7. Синтезований для цього штучний ген ІФН клонували в експресійний вектор рЕТ-24а, який містить Т7 промотор и термінатор. Рекомбінантну плазміду, позначену як рЕТ-αIФН, трансформу­ вали в клітини Е. coli BL (DE3) і синтез ІФН індукували ізопропіл-β-D-тіогалактозидом. Вивчали вплив температури (37 и 21 °С) культивування клітин Е. coli BL (рЕТ-αIФН) на рівень синтезу і вихід розчинного ІФН. Встановлено, що рівень синтезу рекомбінантного білка у перші години після індукції при температурі 37 °С вищий, ніж при 21 °С. Так, через 4 год після індукції вихід ІФН при культивуванні продуцента при 37 °С складає до 20 %, а при 21 °С – лише 7 % від сумарних білків клітини. Однак якщо ІФН експресується при темпера­турі 37 °С, то він накопичується в клітинах у вигляді нерозчинних тілець включень. Показано, що зниження темпе­ратури культивування продуцента після індукції сприяє нако­пиченню цільового білка в розчинній формі. Збільшення трива­лості культивування продуцента при температурі 21 °С до 18 год дозволяє одержувати розчинний ІФН у більшій кіль­кості. Розроблена нами технологія отримання ІФН передба­чає інфікування фагом лямбда клітин Е. coli BL21 (DE3), які містять плазміду з цільовим геном під контролем промотора фага Т7. В результаті лізису клітин штамма-продуцента синтезований цільовий білок вивільняється у середовище для росту, де й накопичується у розчинній формі. За оптимальних умов культивування 1 л фаголізату містить біля 200 мг розчинного ІФН. Отриманий вихід ІФН більш ніж у 2,5 разу вищий порівняно з раніше досягнутим нами виходом розчинно­го ІФН при використанні як продуцента клітин Е. coli SG30 (pIF-16), що несуть плазміду з двома копіями штучного гена ІФН під контролем тандема триптофанових промоторів.

References

[1] Moshko SV. Optimizing the expression of foreign genes in E. coli. Biotekhnologiia. 1998; (6):3—23.
[2] Baneyx F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol. 1999;10(5):411-21.
[3] Balb?s P. Understanding the art of producing protein and nonprotein molecules in Escherichia coli. Mol Biotechnol. 2001;19(3):251-67.
[4] Jonasson P, Liljeqvist S, Nygren PA, St?hl S. Genetic design for facilitated production and recovery of recombinant proteins in Escherichia coli. Biotechnol Appl Biochem. 2002;35(Pt 2):91-105.
[5] Slavchenko IYu. The expression of human alpha-2b interferon in different strains of Escherichia coli. Biopolym Cell. 2001; 17(6):546-50.
[6] Slavchenko IYu. The influence of temperature on the yield soluble human alpha interferon in the system of recombinant proteins overproduction using bacteriophage lambda. Biopolym Cell. 2002; 18(5):436-441.
[7] Slavchenko IYu. The influence of nutrients in growth media on the lysis and extracellular localization of human alpha interferon in the system of recombinant proteins overproduction using bacteriophage lambda. Biopolym Cell. 2002; 18(6):529-533.
[8] Slavchenko IYu, Shmidt VA, Chernykh SI, Kordyum VA. Peculiarities of a target gene expression in the structure of the phage lambda-base vector and investigation of ways of its optimization. Biopolym Cell. 2003; 19(1):81-88.
[9] AS. SSSR N 1092176. A method for preparing an artificial human interferon gene al and method for producing a polypeptide with an interferon activity microbiological synthesis. MN Kolosov, VG Korobko, VN Dobrynin, IV Severtsova, SA Chuvpilo, NS Bystrov, YuA Berlin, AL Kayushin, VV Butkus, IA Polyakova, EF Boldyreva, LS Sandakchiev, SG Popov, TN Shubina, VV Kravchenko, OI Serpinskiy, VF Yamschikov, SI Belikov, AN Sinyakov, GF Sivolobova. Publ. in BI N 18, 1984.
[10] Slavchenko IYu, Boreyko EV, Gavrysh TG, Kostyuchenko IP, Kordyum VA. Biosynthesis of human basic fibroblast growth factor in soluble form in Escherichia coli and its purification. Biopolym Cell. 2003; 19(2):179-184.
[11] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976;72:248-54.
[12] Studier FW, Moffatt BA. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 1986;189(1):113-30.
[13] Carri? MM, Villaverde A. Construction and deconstruction of bacterial inclusion bodies. J Biotechnol. 2002;96(1):3-12.
[14] Slavchenko IYu, Boreyko EV, Vorobey NV, Gavrysh TG, Pehota EN, Kordyum VA. Overexpression and purification of methionine aminopeptidase from Escherichia coli. Biopolym Cell. 2003; 19(3):274-280.