Biopolym. Cell. 2008; 24(5):377-384.
Структура та функції біополімерів
Отримання рекомбінантного дефензину 1 сосни звичайної та його антифунгальна активність
1Ковальова В. А., 1Гут Р. Т., 2Гут І. Т.
  1. Національний лісотехнічний університет України
    вул. Генерала Чупринки, 103, Львів, Україна, 79057
  2. Університетський коледж Лондона
    вул. Гавер, Лондон, WC1E 6BT, Велика Британія

Abstract

Нещодавно нами очищено ендогенний дефензин із проростків сосни звичайної, а також клоновано кДНК, яка кодує дефензин 1 (PsDef1, Pinus sylvestris дефензин 1). Фрагмент кДНК дефензину 1, який кодує зрілу форму цього білка, клоновано у вектор pET42а(+) та індуковано його експресію у бактеріальній системі Escherichia coli. Оптимізовано умови продукування рекомбінантного білка PsDef1, злитого з глутатіон-S-трансферазою, у розчинній формі. Після афінного очищення цього білка на глутатіон-сефарозі та протеолізу фактором Ха отримано біологічно активний препарат рекомбінантного PsDef1, антифунгальна активність якого співмірна з такою ендогенного дефензину 1 сосни звичайної.
Keywords: рекомбінантний дефензин PsDef1, експресія, афінне очищення, антифунгальна активність

References

[1] Broekaert W., Cammue B., DeBolle M., Thevissen K., DeSamblanx G., Osborn R. Antimicrobial peptides from plants Crit. Rev. Plant Sci 1997 16:297–323.
[2] Pogrebnoj P. V. Peptide antibiotics as a factors of mammalian immunity Biopolym. Cell. 1998; 14(6):512-518
[3] Thomma B., Cammue B., Thevissen K. Plant defensins Planta 2002 216:193–202.
[4] Broekaert W., Terras F., Cammue B., Osborn R. Plant defensins: novel antimicrobial peptides as components of the host defense system Plant Physiol 1995 108:1353–1358.
[5] Almeida M., Cabral K., Zingali R., Kurtenbach E. Characterization of two novel defense peptides from pea (Pisum sativum) seeds Arch. Biochem. Biophys 2000 378: 278–286.
[6] Terras F., Schoofs H., de Bolle M., Van Leuven F., Rees S., Vanderleyden J., Cammue B. P., Broekaert W. F. Analysis of two novel classes of plant antifungal proteins from radish (Raphanus sativus L.) seeds. J Biol Chem. 1992;267(22):15301-9.
[7] Segura A., Moreno M., Molina A., Garcia-Olmedo F. Novel defensin subfamily from spinach (Spinacia oleracea) FEBS Lett 1998 435:159–162.
[8] Bloch C., Richardson M. A new family of small (5 kDa) protein inhibitors of insect -amylases from seeds or sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench.) have sequence homologies with wheat – purothionins FEBS Lett 1991 279:101–104.
[9] Wijaya R., Neumann G., Condron R., Hughes A., Polya G. Defense proteins from seed of Cassia fistula include a lipid transfer protein homologue and a protease inhibitory plant defensin Plant Sci 2000 159:243–255.
[10] Lay F. T., Anderson M. A. Defensin – components of the innate immune system in plants Curr. Prot. Pept. Sci 2005 6:85–101.
[11] Gao A. G., Hakimi S. M., Mittanck C. A., Wu Y., Woerner B. M., Stark D. M., Shah D. M., Liang J., Rommens C. M. Fungal pathogen protection in potato by expression of a plant defensin peptide Nat. Biotechnol 2000 18:1307– 1310.
[12] Thomma B., Broekaert W. Tissue-specific expression of plant defensin genes PDF2.1 and PDF2.2 in Arabidopsis thaliana Plant Physiol. Biochem 1998 36:533–537.
[13] Asiegbu F., Nahalkova J., Li G. Pathogen-inducible cDNAs from the interactions of the root rot fungus Heterobasidion annosum with Scots pine (Pinus sylvestris L.) Plant Science 2005 168:365–372.
[14] Kovaleva VA, Gut RT. Isolation of the proteins with antifungal activity from Pinus sylvestris L. seedlings. Fiziologiia i biokhimiia kul'turnykh rasteniy. 2007; 39,(2):129-35.
[15] Kovalyova VA, Gout IT, Gout RT. Characterization of defensin-like proteins from Scots pine seedlings Biopolym Cell. 2006; 22(2):126-31
[16] Koval'ova V. A., Gut R. T. Creation and analysis of gene libraries pine. Nauk. visn. NLTU Ukrayiny. 2007; 17(3):30–34.
[17] Kovalyova V. A., Gout I. T., Kiyamova R. G., Filonenko V. V., Gout R. T. Cloning and analysis of defensin 1 cDNA from Scots pine Biopolym. Cell. 2007; 23(5):398-404
[18] Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual New York: Cold Spring Harbor Lab. publ., 1982 545 p.
[19] Schagger H., von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1–100 kDalton Anal. Biochem 1987 166:368–379.
[20] Broekaert W., Terras F., Cammue B., Vanderleyden J. An automated quantitative assay for fungal growth inhibition FEMS Microbiol. Lett 1990 69:55–60.
[21] Xu H., Reddy A. S. N. Cloning and expression of a PR5-like protein from Arabidopsis: inhibition of fungal growth by bacterially expressed protein Plant. Mol. Biol 1997 34:949–959.
[22] Da-Hui L., Gui-Liang J., Ying-Tao Z., Tie-Min A. Bacterial expression of a Trichosanthes kirilowii defensin (TDEF1) and its antifungal activity on Fusarium oxysporum Appl. Gen. Mol. Biotech 2007 74:146–151.
[23] Thevissen K., Osborn R., Acland D., Broehaert W. Specific binding sites for an antifungal plant defensin from dahlia (Dahlia merckii) on fungal cells are required for antifungal activity Mol. Plant-Microbe Interact 2000 31:54–61.
[24] Osborn R., Desamblanx G., Thevissen K., Goderis I., Torrekenes S., Van Leuven F., Attenborough S., Rees S., Broekaert W. Isolation and characterization of plant defensins from seeds of Asteraceae, Fabaceae, Hippocastanaceae and Saxifragaceae FEBS Lett 1995 368:257–262.
[25] Pervieux I., Bourassa M., Laurans F., Hamelin R., Seguin A. A spruce defensin showing strong antifungal activity and increased transcript accumulation after wounding and jasmonate treatments Physiol. Mol. Plant Pathol 2004 64:331–341.
[26] Kovaleva V., Gout R. Isolation and the antifungal activity of defensin-like protein from Scots pine roots Joint conf. UIFRO «Population genetics and genomics of forest trees: from gene function to evolutionary dynamics and conservation»: Abstract Book Madrid, 2006:188–189.