Biopolym. Cell. 2015; 31(2):109-114.
http://dx.doi.org/10.7124/bc.0008D4
Структура та функції біополімерів
Бактеріальна експресія та ізотопне мічення білка AIMP1 / p43 кодосоми для структурних досліджень мультімерной ЯМР спектроскопії
1, 2Воробєва Н. В., 1, 2Ложко Д. Н., 3, 4Жуков І. Ю., 1, 2Корнелюк О. І.
  1. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
    Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, Україна, 03680
  2. Інститут високих технологій,
    Київський національний університет імені Тараса Шевченка
    пр. Академіка Глушкова 2, кор. 5, Київ, Україна, 03022
  3. Інститут біохімії і біофізики Польської академії наук
    вул. Павінського, 5a, Варшава, Польща, 02-106
  4. NanoBioMedical центр, Университета Адама Міцкевича
    вул. Умултовська 85, Познань, Польща, 61-614

Abstract

AIMP1/p43 – структурний компонент мультисинтетазного комплексу (кодосома) евкаріот, проявляє тРНК зв’язуючу та цитокінову активність. Мета. Провести бактеріальну експресію та очистку ізотопно-міченого рекомбінантнога білка AIMP1/p43 в клітинах E. coli для вивчення його просторової структури методами мультивимірної ЯМР спектроскопії. Методи. AIMP1/p43 був експресованний в клітинах E. coli BL21 (DE3) pLysE на мінімальному середовищі М9 з міченням ізотопом 15N та очищено за допомогою метал-хелатуючої хроматографії. Гетероядерні двомірні 1H-15N ЯМР експерименти проводилися в розчині при температурі 293 К на ЯМР спектрометрі Agilent DDR2 800. Результати. Білок AIMP1/p43 був отриманий в 15N-міченій формі в якості ЯМР зразка. Висока дисперсія сигналів у двомірниї ЯМР спектрах 1H-15N HSQC підтверджує наявність компактної тривимірної структури білка. ЯМР спектр AIMP1/р43 виявляє значне співвідношення сигнал-шум та достатню стабільність, щоб застосувати інші багатовимірні ЯМР експерименти, для визначення структури AIMP1/p43 білка у розчині. Висновки. 15N-мічений білок AIMP1/p43 зберігає стабільність протягом 4–7 днів, що дає можливість подальшого отримання важливих ЯМР експериментів для проведення детального структурного аналізу білка у розчині. Наші дані первинного аналізу даних ЯМР вказують на присутність деяких додаткових сигналів у порівнянні зі спектрами ЯМР EMAP II, які можуть бути віднесені до амінокислот N-кінцевий α-спірального фрагмента AIMP1/р43.
Keywords: цитокіни, AIMP1/р43, експресія білка, ізотопне мічення, ЯМР спектроскопія
Повний текст: (PDF, англійською)

References

[1] Wolfe CL, Warrington JA, Davis S, Green S, Norcum MT. Isolation and characterization of human nuclear and cytosolic multisynthetase complexes and the intracellular distribution of p43/EMAPII. Protein Sci. 2003;12(10):2282-90.
[2] Fu Y, Kim Y, Jin KS, Kim HS, Kim JH, Wang D, Park M, Jo CH, Kwon NH, Kim D, Kim MH, Jeon YH, Hwang KY, Kim S, Cho Y. Structure of the ArgRS-GlnRS-AIMP1 complex and its implications for mammalian translation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(42):15084-9.
[3] Guigou L, Shalak V, Mirande M. The tRNA-interacting factor p43 associates with mammalian arginyl-tRNA synthetase but does not modify its tRNA aminoacylation properties. Biochemistry. 2004;43(15):4592-600.
[4] Girek T, Goszczy?ski T, Girek B, Ciesielski W, Boraty?ski J, Rychter P. ?-Cyclodextrin/protein conjugates as a innovative drug systems: synthesis and MS investigation. J Incl Phe­nom Macrocycl Chem. 2012;75(3–4):293–6.
[5] Quevillon S, Mirande M. The p18 component of the multisynthetase complex shares a protein motif with the beta and gamma subunits of eukaryotic elongation factor 1. FEBS Lett. 1996;395(1):63-7.
[6] Reznikov AG, Chaykovskaya LV, Polyakova LI, Kornelyuk AI. Antitumor effect of endothelial monocyte-activating polypeptide-II on human prostate adenocarcinoma in mouse xenograft model. Exp Oncol. 2007;29(4):267-71.
[7] Reznikov AG, Chaykovskaya LV, Polyakova LI, Kornelyuk AI, Grygorenko VN. Cooperative antitumor effect of endothe­lial-monocyte activating polypeptide II and flutamide on human prostate cancer xenografts. Exp Oncol. 2011;33(4): 231–4.
[8] Ivakhno SS, Kornelyuk AI. Cytokine-like activities of some aminoacyl-tRNA synthetases and auxiliary p43 cofactor of aminoacylation reaction and their role in oncogenesis. Exp Oncol. 2004;26(4):250-5.
[9] Park H, Park SG, Kim J, Ko YG, Kim S. Signaling pathways for TNF production induced by human aminoacyl-tRNA synthetase-associating factor, p43. Cytokine. 2002;20(4):148-53.
[10] Park SG, Kang YS, Ahn YH, Lee SH, Kim KR, Kim KW, Koh GY, Ko YG, Kim S. Dose-dependent biphasic activity of tRNA synthetase-associating factor, p43, in angiogenesis. J Biol Chem. 2002;277(47):45243-8.
[11] Park H, Park SG, Lee JW, Kim T, Kim G, Ko YG, Kim S. Monocyte cell adhesion induced by a human aminoacyl-tRNA synthetase-associated factor, p43: identification of the related adhesion molecules and signal pathways. J Leukoc Biol. 2002;71(2):223-30.
[12] Ko YG, Park H, Kim T, Lee JW, Park SG, Seol W, Kim JE, Lee WH, Kim SH, Park JE, Kim S. A cofactor of tRNA syn­the­tase, p43, is secreted to up-regulate proinflammatory ge­nes. J Biol Chem. 2001;276(25):23028–33.
[13] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976;72:248-54.
[14] Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680-5.
[15] Delaglio F, Grzesiek S, Vuister GW, Zhu G, Pfeifer J, Bax A. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J Biomol NMR. 1995;6(3):277-93.
[16] Goddard TD, Kneller DG. SPARKY 3. San Francisco: Univ. of California. 2008.
[17] Lozhko DM, Zhukov IY, Kornelyuk AI. Bacterial expression and 13C. 15N isotopic labeling of EMA PII cytokine for struc­tural studies by NMR spectroscopy. Biopolym Cell. 2011;27 (4):273–8.
[18] Lozhko D, Stanek J, Kazimierczuk K, Zawadzka-Kazimierczuk A, Kozminski W, Zhukov I, Kornelyuk A. (1)H, (13)C, and (15)N chemical shifts assignments for human endothelial monocyte-activating polypeptide EMAP II. Biomol NMR Assign. 2013;7(1):25-9.