Передумови. Порівняно з длДНК, одноланцюгова ДНК (олДНК) має більшу структурну гнучкість, меншу імуногенність і використовується у гомологічно орієнтованому відновленні CRISPR-Cas9, рекомбіназних вставках, молекулярних зондах та експресійних векторах. Ми розробили протокол на основі селективної деградації 5′–3′-фосфорильованої длДНК 5′, а потім магнітного карбоксилованого захоплення кульки для генерації та очищення олДНК на рівні трансфекції на рівні μg, для імунокомпетентних клітин ссавців. Методи. Вхідна длДНК була отримана за допомогою препаративної ПЛР (Q5 ДНК полімераза, 5′-фосфорилований праймер), очищена магнітними гранулами AmpliClean™ і перещеплена за допомогою Lambda exo (NEB). олДНК була очищена за допомогою Quick-DNA/™ RNA MagBeads (Zymo Research) та перевірена за допомогою електрофорезу агарозного гелю. Залишкова длДНК була кількісно визначена за допомогою Qubit™ 1X длДНК HS Assay після розщеплення нуклеази S1. Ендотоксини вимірювалися за кінетичним протоколом PyroSmart NextGen®. Результати. Для масштабування стандартного розщеплення Lambda exo (100 нг/мкл, 1 U/мкг ДНК, інкубація за 30 хвилин) до реакції 100 мкл з 20 мкг дсДНК титровали співвідношення фермент-субстрат і час інкубації. Повне розщеплення було досягнуто при співвідношенні ферментів до субстратів 1,25 U/μg без порушення нефосфорилованого ланцюга. Оптимальний час інкубації масштабований за довжиною фрагмента: 2 год (>3500 п.п.), 1.5 год (>1500 п.п.) та 1 год (<500 bp). Оскільки Lambda exo травники зберігали стабільну частку залишкової длДНК навіть під час перетравлення, було проведено ферментативне видалення за допомогою нуклеаз, селективних длДНК (ExoIII (NEB) та ezDNase™ (ThermoFisher)). За всіх тестованих умов жодна з нуклеаз не показала необхідної селективності, що спричинило значне руйнування олДНК, ймовірно через залишкові вторинні структури. Потім ми виміряли екстракцію® реагента TRI (Sigma) та Quick-DNA/™ RNA MagBeads для селективного захоплення олДНК. Вилучення реагента TRI® призвело до відновлення як олДНК, так і длДНК в органічній фазі, Quick-DNA/RNA™ MagBeads успішно ізолували чисту олДНК у незв'язаній фракції (поведінка рекапітуляції РНК). Протокол тестували на різних навантаженнях длДНК, що підтвердило надійну продуктивність до 20 мкг початкового масового навантаження. Оброблена олДНК зберігала свою однорідність на всіх етапах обробки, даючи <2% залишкового транспорту длДНК та ендотоксини <0.08 EU/µg у фінальній підготовці при повному складі 33-52% (для найдовших і найкоротших фрагментів відповідно). Висновки. Наш оптимізований протокол Lambda exo ефективно масштабує виробництво олДНК на різних розмірах фрагментів. У поєднанні з очищенням Quick-DNA/RNA™ MagBeads він надійно виробляє однорідну, низько-длДНК та безендотоксидну олДНК, придатну для трансфекції клітин ссавців.