Передумови. РНК-терапія стає важливим терапевтичним методом. Однак скринінг великих бібліотек мРНК залишається складним через варіативність і якість, пов'язані зі скринінгом in vitro транскрипцій (IVT). Для прискорення цього процесу ми пропонуємо внутрішньоклітинну систему синтезу РНК, яка дозволяє пряму транскрипцію кандидатів на основі фагової односубодиничної полімерази в клітинах. Це дозволяє надійно проводити скринінг кандидатів у РНК без варіативності, введеної IVT, полегшуючи оцінку рибозимів і аптамерів у відповідних клітинних середовищах. Мета. Розробка ортогональної транскрипції на основі T7 RNAP у клітинах ссавців. Методи. Конструкції експресії RNAP для T7 (mCMV-промотер, химерний Intron A, Myc-код оптимізований T7 RNAP ORF та елемент SV40 pA або репортерний елемент (EMCV IRES LP і CyOFP1)) були зібрані двоетапною збіркою Golden Gate із використанням PaqCI (NEB) з проміжним ПЛР для повторного введення місць PaqCI. Репортерні конструкції (промотер T7, опціональний DiLCR(WT), EMCV IRES, hGluc-Dura CDS, pA120, термінатор T7) були зібрані двоетапним Golden Gate за допомогою PaqCI (NEB). Плазміди без ендотоксинів доставлялися до клітин CHO-DG44 шляхом електропорації (Neon NxT, 1600V, 3*10ms), клітини переносили до Cellvento 4CHO SFM з 8 мМ глутаміну, а після 4, 26, 52 та 72 годин при 37°C аліквоти збирали та кількісно оцінювали за допомогою GLuc (Pierce Gaussia Luciferase Glow Assay Assay Kit). Результати. Експресія T7 RNAP у клітинах CHO була підтверджена за допомогою проточної цитометрії (anti-MycTag), при цьому котранскрипційний репортер CyOFP1 не мав впливу на експресію. Плазміди T7 RNAP з репортером і T7 з репортером виробляли сигнал люциферази, починаючи через 4 години після трансфекції, досягаючи 64% трансфекції ARCA-закритого сигналу репортера мРНК при 2,86x молярному навантаженні за 26 годин. Транскрипція з репортера, керованого pT7, не вплинула на транскрипцію конструкції T7 RNAP, виміряної як експресія CyOFP1 за відсутності шаблону pT7. Крім того, під час котрансфекції конструкта pT7, дефіцитної в IRES, не виявлено активності люциферази, що підтверджує ортогональність транскрипції на основі ядерної РНК-полімерази II. Титрування плазміди, що містить pT7, підтверджує лінійну дозозу-залежну відповідь у діапазоні 1-16 нМ у всіх періодах тестування від 6 до 50 годин, що підтверджує гіпотезу цитоплазматичної транскрипції. Висновки. Ми продемонстрували ортогональну систему експресії на основі T7 RNAP у клітинах ссавців, яка дозволяє експресію транфекційних плазмід з pT7 in cellulo із залежного від накопиченої дози продукту шаблону. Майбутні дослідження будуть зосереджені на валідації скроневої системи та розробці стабільної клітинної лінії на основі CHO як високопродуктивного скринінгового хазяїна для мРНК-конструкцій.