Передумови. Нуклеази CRISPR, такі як Cas9 і Cas12a, є ключовими інструментами редагування геному, однак їхня ефективність обмежена обмеженою сумісністю PAM (протоспейсер-сусідній мотив), нецільовим розщепленням і неефективною доставкою ядер. Системи бактеріального відбору, що пов'язують розділення ДНК для виживання за допомогою токсину під індуктованим промоутером, забезпечують прямий зв'язок генотип–фенотип, необхідний для масштабного скринінгу великих бібліотек варіантів з метою створення оптимізованих нуклеаз. Мета. Розробка та валідація індукованої системи на основі токсинів ccdB для масового паралельного аналізу репортерів (MPRA) активності нуклеази CRISPR у E. coli, перетворюючи виживання клітин у кількісний, секвеновуваний індикатор. Методи. ccdB був ампліфікований ПЛР з pTypeIIS і введений у спеціалізовану плазміду pRSFYP за допомогою збірки Golden Gate; потім ослаблена послідовність Shine–Dalgarno (SD) була введена шляхом мутагенезу, спрямованої на місце. Оптимізований кодоном ссавців ErCas12a та його каталізаторно мертвий варіант (dErCas12a) були клоновані в pGEX за допомогою касети з ccdB-спрямованою gRNA касетою під промоутером J23119. Для скринінгу 1 нг плазміди, що кодує функціональний або неактивний ErCas12a під tac-промоутером, перетворювався на DH10B клітини з pRSFYP-ccdB і покритий LB-агаром 0,2% арабінози та 50 мкг/мл хлорамфеніколу (37 °C, вночі). Колонії були перераховані за алгоритмом Cellpose-SAM. Результати. Дизайн першого покоління pRSFYP-ccdB з рідним SD не виявив ізоляції трансформатора у чутливих E. coli навіть без індукції токсинів. Введення послабленого SD і титрування арабіндукованого індуктора зменшили витік ccdB, досягнувши 7,25 × 10⁷ CFU/ug без індукції. Порівняльна оцінка WT ErCas12a (цільових і нетаргетованих crRNA) порівняно з dErCas12a показала відсутність зростання на пластинах Ara+IPTG+ для WT з цільовою crRNA, а також порівнянні показники для WT з нетаргетованими crRNA та dErCas12a. Однак конструкції WT залишалися активними без індукції IPTG, можливо, через витік тактичного промоутера (тактичного промоутера). Масштабування протоколу дало ~50 тисяч колоній на 14 см пластину, що було достатньо для кількісного покриття бібліотек функціональних варіантів з ~10³ на одній пластині. Висновки. Ми створили систему MPRA на основі токсину ccdB, індуктованого арабінозою, і, використовуючи функціональний і неактивний ErCas12a, продемонстрували можливість масового паралельного скринінгу варіантів Cas12a. Майбутні дослідження мають мінімізувати базальну експресію ErCas12a за рахунок оптимальних рівнів IPTG та суворішого контролю промоутерів.