Передумови. Каталітично неактивний Cas12a (dCas12a) дозволяє надійно проєктувати мультиплексовані активатори CRISPR (CRISPRa) із використанням обробки вроджених crRNA масивів. Зв'язування Cas12a-CRISPRa з багатовалентними активаційними каркасами концентрує транскрипційні активаторні домени (TAD) на цільових промоутерах, забезпечуючи ефективну, позиційно інваріантну арегуляцію генів. CRISPRa на основі dErCas12a є перспективними IP-дружніми ефекторами для комерційної інженерії клітинних ліній, але жодних мультивалентних активаторів на основі dCas12a не було охарактеризовано. Мета. Порівняльна активність мультивалентних фреймворків на основі міток афінності GCN/ALFAtag при різних багатовалентностях та альтернативних TADs для активатора dErCas12a у аналізі клітинного транскрипційного репортеру. Методи. Усі білки злиття експресувалися як конструкції, керовані mCMV. dErCas12a, асоційований із повтореннями 10x/3xALFAtag або 10x/3xGCN, комбінувався з TAD fusion (VPR або P65-HSF1) з нанотілом ALFAtag або scFv відповідно. Пряме злиття dErCas12a-VPR слугувало позитивним контролем. Попередньо валідований crRNN, націлеспрямований на miniCMV, експресувався U6 з одного вектора. Клітини CHO-K1, що експресували miniCMV-контрольований CyOFP1, були електропоровані у потрійній формі за допомогою трьох конструкцій: мічених нуклеаз; відповідних TAD; crRNA-касети. Через 72 години активацію аналізували за допомогою потокової цитометрії. Трансформована Боксом-Коксом (lambda = –0,203) активність, нормалізована до нуклеазних та активаторних репортерних сигналів, була змодельована за дворівневою повнофакторною моделлю, що включала всі три фактори та двофакторні взаємодії. Результати. Найвища активність була зафіксована в активаторах на базі ALFAtag: 12,5 рази для 3X-VPR і 9,5 рази для 10X-P65-HSF1; проти 6,5 разів для контролів dErCas12a-VPR. Зменшена факторіальна модель (R2adj = 0,978, pLOF = 0,14; стандартизований розмір ефекту (SES) вказаний для кожного фактора нижче) зберігала всі фактори значущими, ідентифікуючи ALFAtag (20,4982 SES) та VPR (18,0275 SES) як найсильніші фактори у конструкціях з високою специфічною активністю. Значно сильніші умови взаємодії для багатовалентності меток афінності (10,7128 SES) та TAD (10,3193 SES) порівняно з монономіальним ефектом (4,1179 SES) показують, що мультимеризація TAD сильно залежить від архітектури конструкта . Усі умови показали значне зниження життєздатності, корелююче зі специфічною активністю, що свідчить про складний профіль токсичності. Висновки. Вперше було продемонстровано багатовалентні фреймворкові системи dErCas1 2a-CRISPRa, які перевершуватимуть класичні системи прямого синтезу. Майбутні проєкти вимагатимуть ретельної оптимізації багатовалентності для конкретних TAD, щоб максимізувати специфічну активність при зниженні токсичності транскрипції.