Мета. Розробити високоефективну систему MAD7 нуклеази для видалення глутамінсинтетази (GS) у клітинах CHO-K1 з розробкою оптимізованого хазяїна для виробництва терапевтичного рекомбінантного білка. Методи. Ген GS (Glul), що націлює на крРНК, був розроблений за допомогою інструменту Chopchop і проаналізований in vitro тестом із використанням MAD7-лізатів, IVT крРНК та фрагментів Glul ПЛР. Редагування CHO-K1 проводилося шляхом електропорації МРНК IVT, оптимізованої MAD7-кодоном (30 нМ), крРНК доставлялася як експресія пДНК (30 нМ) або синтетичний оліго (3 мкМ). Ефективність редагування на одному місці оцінювалася за допомогою тесту на невідповідність ендонуклеази T7 (T7E). Видалення розміру гена проводилося шляхом котрансфекції з мРНК MAD7 разом із двома крРНК, розташованими по боках Glul. Клони окремих клітин (SCC), отримані за допомогою FACS, були скриніновані за допомогою ПЛР, посилилюючи видалену частиту розв'язки та контрольну цілу частину (delПЛР) для підтвердження делеції біалель. Для валідації фенотипу Glul-/- відібрані клони порівнювали за ростом у середовищі з L-глутаміном і без нього. Результати. 7 кандидатів на активні крРНК, ідентифікованих за допомогою скринінгу in vitro, були валідовані в клітинах CHO-K1. крРНК 3 і 14 показали найвищу ефективність редагування в тестах T7E (69% і 63%). Ця пара охоплює область Glul 6kb 10kb, охоплюючи кодуючі послідовності екзонів 2–7. Клітини CHO-K1 були котрансфектовані з крРНК 3 і 14, що експресували пДНК і MAD7 мРНК, а потім піддавалися впливу SCC. З 52 збільшених клонів delПЛР виявила 7 гомозиготних і 2 гетерозиготних делецій, що відповідає ефективності видалення алелів 15,6%. Смуга делеції показала прогнозовану втрату 6 kb. За наявності 8 mM L-глутаміну всі клони з редагованим MAD7 подвоювали кількість порівнянних із WT-клітинами (18–21 год). Під час голодування глутаміну клони з видалення Glul не мають ознак проліферації, на відміну від WT-клітин. Щоб зменшити ризик небажаного вставлення геному пДНК та підвищити гнучкість дизайну, ми вдосконалюємо систему редагування генів MAD7, оптимізуючи доставку крРНК як синтетичний оліго 2O-Me. Котрансфекція мРНК MAD7 з оліго-крРНК забезпечує на 20% меншу ефективність редагування порівняно з експресією крРНК у тесті T7E через швидке розпадання РНК in cellulo для експресії білка MAD7. Затримка доставки крРНК через 10 годин після трансфекції MAD7 забезпечила 62% ефективність як для пДНК-вектора, так і для синтетичного оліго, при цьому зберігаючи хорошу життєздатність клітин і ефективність клонування. Висновки. Ми розробили систему редагування генів на основі повноцінної РНК MAD7 і продемонстрували її здатність виконувати Glul-видалення розміру гена в клітинах CHO-K1, створюючи клітинну лінію хазяїна, придатну для метаболічного стабільного відбору на основі GS.