Biopolym. Cell. 2026; 42(Special Issue):21.
Розробка рекомбінантних білків та моноклональних антитіл
Ефективне виробництво EGF та VEGF людини у Escherichia coli
- Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, Україна, 03143 - Інститут генетичної та регенеративної медицини, ДУ “Національний
науковий центр “Інститут кардіології, клінічної та регенеративної медицини
ім. академіка М.Д. Стражеска НАМН України”
вул. Святослава Хороброго, 5, Київ, Україна, 03151 - ДУ «Інститут генетичної і регенеративної медицини НАМН України»
вул. Вишгородська, 67, Київ, Україна, 04114 - Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
вул. Леонтовича, 9, Київ, Україна, 01054
Abstract
Передумови/Мета. Рекомбінантний судинний ендотеліальний фактор росту (rhVEGF) та епідермальний фактор росту (rhEGF) є надзвичайно важливими для біомедичних досліджень і регенеративної медицини. Системи експресії бактерій забезпечують економічно вигідну платформу для їх виробництва; однак досягнення розчинних, біологічно активних форм залишається значним викликом. Метою було розробити та оптимізувати системи експресії на основі E. coli для rhVEGF і rhEGF, а також отримати обидва білки у розчинної, активній формі. Методи. Цільові гени були клоновані у вектор pET-24b і експресовані в E. coli BL21 Rosetta (DE3). Два методи індукції експресії — індукція IPTG та автоіндукція — були протестовані та порівняні для кожного рекомбінантного білка. Профілі експресії аналізувалися за допомогою SDS-PAGE. Очищення rhEGF-His та rhVEGF-His було досягнуто за допомогою хроматографії з афінністю з метало-афінністю; тоді як вільний pEGF очищався за допомогою іоннообмінної хроматографії. Біологічна активність обох очищених варіантів rhEGF оцінювалася за допомогою тесту життєздатності клітин фібробластів 3T3. Результати. Обидва індукційні підходи успішно експресували rhVEGF і rhEGF. Аналіз SDS-PAGE показав, що автоіндукція при 37°C дає більшу частку розчинного rhVEGF порівняно з індукцією на основі IPTG. Натомість індукція на основі IPTG при 30°C була ефективнішою для виробництва розчинного rhEGF. Оцінка біологічної активності за допомогою фібробластів 3T3 показала, що обидва очищені препарати rhEGF залишаються функціональними, причому немаркований білок підвищує життєздатність клітин приблизно на 30% ефективніше, ніж форма з міткою His. Висновки. Автоіндукція при 37°C є переважним методом для отримання розчинного rhVEGF у системі Rosetta pET-24b/BL21, тоді як індукція на основі IPTG при 30°C більш підходить для rhEGF. Успішна експресія та очищення rhEGF були досягнуті у двох різних формах, і обидва варіанти зберігали біологічну активність. Немаркований білок продемонстрував вищу біологічну активність, ніж аналог з міткою His. Ці результати слугують основою масштабованого бактеріального виробництва клінічно значущих рекомбінантних факторів росту.
Keywords: VEGF, EGF, Escherichia coli, автоіндукція, IPTG, pET-24b, очищення білка, біологічна активність
Повний текст: (PDF, англійською)
