Biopolym. Cell. 2026; 42(Special Issue):21.
Розробка рекомбінантних білків та моноклональних антитіл
Ефективне виробництво EGF та VEGF людини у Escherichia coli
1Скварчинський А. І., 1, 2, 3Усенко М. О., 1, 2, 3Горбатюк О. Б., 4Колибо Д. В., 1, 2, 3Кордюм В. А.
  1. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
    Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, Україна, 03143
  2. Інститут генетичної та регенеративної медицини, ДУ “Національний
    науковий центр “Інститут кардіології, клінічної та регенеративної медицини
    ім. академіка М.Д. Стражеска НАМН України”
    вул. Святослава Хороброго, 5, Київ, Україна, 03151
  3. ДУ «Інститут генетичної і регенеративної медицини НАМН України»
    вул. Вишгородська, 67, Київ, Україна, 04114
  4. Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
    вул. Леонтовича, 9, Київ, Україна, 01054

Abstract

Передумови/Мета. Рекомбінантний судинний ендотеліальний фактор росту (rhVEGF) та епідермальний фактор росту (rhEGF) є надзвичайно важливими для біомедичних досліджень і регенеративної медицини. Системи експресії бактерій забезпечують економічно вигідну платформу для їх виробництва; однак досягнення розчинних, біологічно активних форм залишається значним викликом. Метою було розробити та оптимізувати системи експресії на основі E. coli для rhVEGF і rhEGF, а також отримати обидва білки у розчинної, активній формі. Методи. Цільові гени були клоновані у вектор pET-24b і експресовані в E. coli BL21 Rosetta (DE3). Два методи індукції експресії — індукція IPTG та автоіндукція — були протестовані та порівняні для кожного рекомбінантного білка. Профілі експресії аналізувалися за допомогою SDS-PAGE. Очищення rhEGF-His та rhVEGF-His було досягнуто за допомогою хроматографії з афінністю з метало-афінністю; тоді як вільний pEGF очищався за допомогою іоннообмінної хроматографії. Біологічна активність обох очищених варіантів rhEGF оцінювалася за допомогою тесту життєздатності клітин фібробластів 3T3. Результати. Обидва індукційні підходи успішно експресували rhVEGF і rhEGF. Аналіз SDS-PAGE показав, що автоіндукція при 37°C дає більшу частку розчинного rhVEGF порівняно з індукцією на основі IPTG. Натомість індукція на основі IPTG при 30°C була ефективнішою для виробництва розчинного rhEGF. Оцінка біологічної активності за допомогою фібробластів 3T3 показала, що обидва очищені препарати rhEGF залишаються функціональними, причому немаркований білок підвищує життєздатність клітин приблизно на 30% ефективніше, ніж форма з міткою His. Висновки. Автоіндукція при 37°C є переважним методом для отримання розчинного rhVEGF у системі Rosetta pET-24b/BL21, тоді як індукція на основі IPTG при 30°C більш підходить для rhEGF. Успішна експресія та очищення rhEGF були досягнуті у двох різних формах, і обидва варіанти зберігали біологічну активність. Немаркований білок продемонстрував вищу біологічну активність, ніж аналог з міткою His. Ці результати слугують основою масштабованого бактеріального виробництва клінічно значущих рекомбінантних факторів росту.
Keywords: VEGF, EGF, Escherichia coli, автоіндукція, IPTG, pET-24b, очищення білка, біологічна активність